УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА PI-TA, PI-B

И.А. ШИЛОВ¹, доктор биологических наук, зав. лабораторией (Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.)
О.С. КОЛОБОВА¹, cтарший научный сотрудник
Ю.В. АНИСКИНА¹, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Т.В. ШАЛАЕВА¹, стажёр-исследователь
Н.С. ВЕЛИШАЕВА¹, кандидат биологических наук, cтарший научный сотрудник
П.Н. КОСТЫЛЕВ², доктор сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией (Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.)
Е.В. ДУБИНА³, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.)
¹Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, ул. Тимирязевская, 42, Москва, 127550, Российская Федерация
²Всероссийский научно-исследовательский институт зерновых культур им. И.Г. Калиненко, Научный городок, 3, Зерноград, 347740, Российская Федерация
³Всероссийский научно-исследовательский институт риса, пос. Белозёрный, 3, Краснодар, 350921, Российская Федерация

Резюме. Для определения аллельного состояния генов устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta и Pi-b давно разработаны маркеры полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мы создали технологию анализа аллельного состояния этих генов методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Исследовали 17 гибридов риса второго поколения, полученных от скрещивания растений-доноров устойчивости к пирикуляриозу с российскими сортами в стратегии пирамидирования (300 растений). Для дизайна праймеров и зондов на ген Pi-ta использовали нуклеотидные последовательности доминантной (сорт Yashiro-mochi, AF207842) и рецессивной аллелей (сорт Tsuyake, AY196754). Для идентификации аллельного состояния гена Pi-b модифицировали известные праймеры (Супрун И.И., Ильницкая Е.Т., Мухина Ж.М., 2007) – добавили 1 нуклеотид на 3’-конец для оптимизации температуры отжига. Для дизайна зондов использовали нуклеотидные последовательности AB026839 с геном устойчивости Pi-b и неустойчивой формы AP004048. ПЦР проводили в 25 мкл раствора, содержащего ПЦР-буфер, 1,25 ед. Тaq ДНК-полимеразы, 100 мкмоль dNTP, по 10 пкмоль каждого праймера, 5 пкмоль зондов и 5 мкл раствора ДНК. Амплификацию осуществляли при 95 оC, 10 мин, 40 циклов. У устойчивых гомозиготных доминантных по гену Pi-ta растений отмечен рост флуоресценции по каналу FAM; у восприимчивых гомозиготных растений – по каналу R6G; у гибридных гетерозигот – по обоим каналам. У устойчивых гомозиготных по гену Pi-b растений наблюдали рост флуоресценции по каналу ROX; у восприимчивых гомозиготных – по каналу R6G; у гетерозигот – по обоим каналам. Использование флуоресцентных меток зондов позволило применить 96-луночный планшет и роботизированную раскапывающую станцию. Разработанные системы использовали во ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко при создании устойчивых к пирикуляриозу сортов риса. Найдено 13 растений, гомозиготных одновременно по генам Pi-ta и Pi-b и гомозиготные формы, несущие эти гены по отдельности.

Ключевые слова: рис, донор, устойчивость к пирикуляриозу, гены Pi-ta, Pi-b, гибрид, маркер, ПЦР-РВ.

Для цитирования: Усовершенствование метода идентификации генов устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta и Pi-b / И.А. Шилов, О.С. Колобова, Ю.В. Анискина, Т.В. Шалаева, Н.С. Велишаева, П.Н. Костылев, Е.В. Дубина // Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 8. С. 45-48.